抗生素的過度使用給城市水環境帶來了很多潛在問題，尤其是抗性菌和抗性基因的傳播，將會對人類的健康產生嚴重威脅。市政污水處理廠、制藥廠和醫院的水處理設施都存在不同濃度的各種抗生素殘留，據報道，在醫院廢水中檢測出的huan bing sha xing濃度為125μg/L、tu mei su濃度為2.2mg/L、磺胺甲惡唑濃度為1.3mg/L。在兩座城市污水處理廠的二級出水中也檢測出濃度為3.6~1176ng/L不等的磺胺類、四環素類、大環內酯類抗生素。存在于環境中的低濃度抗生素會導致耐藥性菌和耐藥性基因的出現和傳播。
四環素類抗生素作為典型的抗生素，在養殖場廢水中經常被檢測到且濃度相對較高，甚至達到388μg/L。并且，四環素廢水具有難處理的特點，如果處理不當可能會導致具有四環素抗性的微生物帶來的潛在健康風險。為此，以tu mei su(OTC)、jin mei su(CTC)、四環素(TC)作為四環素類抗生素的代表性藥物，考察曝氣生物濾池(BAF)對污水中抗生素的深度去除效果。
BAF工藝常用于污水處理，對難降解污染物具有良好的去除效果。探究了不同水力停留時間(HRT)、不同抗生素濃度條件下BAF對四環素廢水中污染物的去除特性。同時，通過分析BAF生物膜中微生物群落結構，探究不同抗生素濃度、不同水力停留時間下反應器中微生物種群的演替規律。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置
曝氣生物濾池采用上部進水的方式，水緩慢經過濾料層和承托層，由底部流量計控制出水，如圖1所示。共制作了兩組高為200cm、內徑為5cm的下向流BAF反應器，分別記作1#和2#。反應器采用陶粒填料，粒徑為3~5mm，填裝高度為1m。底部采用曝氣泵曝氣，控制溶解氧(DO)在4~6mg/L，通過改變進水流量控制不同的水力停留時間，采用標準方法采集裝置進水和出水。BAF采用氣、水聯合反沖洗，反沖洗周期根據運行階段的不同控制在3~10d。
1.2 原水水質及分析方法
模擬某制藥廠抗生素廢水二級生化處理單元出水，COD為40~90mg/L，氨氮為5~10mg/L。反應器掛膜所用污泥取自天津市某污水處理廠沉淀池，采用快速接種法啟動。
1#反應器馴化20d穩定運行后，分為五個階段運行，進水抗生素濃度均控制在200μg/L，每個階段的HRT依次為1、3、5、10、20h，每階段運行25d。2#反應器分三個階段運行，水力停留時間均為10h，各階段的抗生素濃度依次為200、600、1000μg/L，每階段運行25d，分別考察不同階段的處理效果。
COD、氨氮、TP等采用標準方法測定，使用便攜式溶氧儀(JPB-607A)測定DO。tu mei su、jin mei su、四環素采用高效液相色譜法(HPLC)測定，C18色譜柱，測定條件：進樣量為100μL，柱溫為30℃，流動相為甲酸/乙腈(20∶80)，檢測波長為355nm，流速為1mL/min，OTC、CTC、TC出峰時間分別為3.01、3.23、3.69min。
1.3 微生物群落分析
在不同時間段取微生物樣品3個，分別為樣品Ⅰ：1#濾柱未投加抗生素、HRT為1h且穩定運行后第25天的生物膜樣品；樣品Ⅱ：1#濾柱投加3種200μg/L四環素類抗生素、HRT為1h而且穩定運行后第25天的生物膜樣品；樣品Ⅲ：1#濾柱投加3種200μg/L四環素類抗生素、HRT為10h且穩定運行后第25天的生物膜樣品。
采集的樣品由生物工程(上海)股份有限公司檢測。使用E.Z.N.A™Mag-BindSoilDNAKit試劑盒進行DNA的提取。利用Qubit3.0DNA檢測試劑盒對DNA精確定量，用引物341F(5'-CCTAC?GGGNGGCWGCAG-3')和805R(5'-GACTACH?VGGGTATCTAATCC-3')擴增細菌16SrRNA基因的V3-V4區，PCR實驗條件參考文獻。PCR產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在IlluminaMiSeq平臺上測序。
2、結果與討論
2.1 HRT對COD、氨氮去除效果的影響
1#反應器經過20d的馴化，穩定運行后同時加入濃度為200μg/L的CTC、OTC和TC，其間DO控制在(5±1)mg/L。不同階段BAF對COD、氨氮的去除效果如圖2所示。HRT作為BAF重要的運行參數，直接影響反應器內生物膜生長和出水效果，不同HRT條件下污染物去除率有明顯差異。總體上COD去除率隨HRT的延長而增加。當HRT延長時，濾池中水流速度相對緩慢，濾料充分發揮了截留作用，污染物與濾池中的微生物得到充分接觸而被去除。如圖2(a)所示，當HRT從3h增加到20h，COD去除效果持續提升，去除率最大可達88%。
抗生素投加初期對COD的去除產生影響，經過一段時間的恢復后，隨著HRT的增加，COD去除效果逐漸增加。在HRT從1h增加到3h階段，COD去除率有減小的趨勢。可能是因為抗生素的加入對生物膜產生影響，沒有得到wan quan恢復。
從圖2(b)可以看出，在初期氨氮去除率受到抗生素投加的影響有所波動，因為可能是硝化細菌對抗生素比較敏感，導致硝化效果受到影響。隨著HRT的增加，氨氮去除率增加相對明顯，當HRT從10h增加到20h時，氨氮去除率增加趨于平緩。氨氮整體去除率在97%~99%左右，表明BAF的硝化性能很好。由于BAF運行到第四階段時，COD和氨氮去除率已達到較高水平，所以后期實驗BAF的HRT均控制為10h。
2.2 BAF對抗生素的去除效果
2.2.1 HRT對去除效果的影響
第一階段出水CTC、OTC和TC濃度在20d左右達到穩定，濃度分別為95、75和80μg/L，去除率分別為48%、62.5%和60%。HRT對抗生素的去除率有著顯著影響，延長HRT能夠明顯提高對抗生素的去除效果(見圖3)。在第二和第三階段，OTC和TC去除率增加，分別為75%和78%，HRT對CTC的去除率影響大于OTC和TC，在HRT為5h時，CTC去除率就達到了99%以上。持續加大HRT，OTC和TC去除率最高分別可以達到85%和82.5%。總體來講，BAF對四環素類抗生素有較好的去除效果，增加HRT可以明顯提高BAF的去除率。Casas等人證明在慢速生物濾池中，污染物去除效率取決于HRT，HRT最長的實驗對多種抗生素都具有很高的去除率。
2.2.2 對不同濃度抗生素的去除效果
四環素類抗生素的生物降解效果較差，且對微生物具有抑制作用，隨著濃度的增加，在HRT為10h條件下，2#反應器對CTC、OTC、TC的去除率見圖4。
從圖4可以看出，隨著進水抗生素濃度的不斷增加，BAF對CTC的去除效果仍能保持穩定，去除率一直保持在99%以上；而對OTC和TC的去除率呈現逐漸增加的趨勢，在濃度為200、600和1000μg/L時，BAF對OTC的平均去除率分別為80%、92%和95%，對TC的平均去除率分別為85%、93%和95%。在生物濾柱中抗生素可以通過光解、水解、吸附和生物降解去除，有研究顯示，污水中的四環素類抗生素主要依靠吸附得到有效去除，生物降解比較緩慢。也有研究表明，在反應器中TC主要通過生物降解作用去除，而生物吸附對去除TC的貢獻不顯著。雖然對于生物濾柱中抗生素的主要去除途徑沒有統一的定論，但是在生物濾柱中大多數抗生素都會被微生物不同程度地降解。本實驗中在其他條件不變的情況下，提高進水抗生素濃度至1000μg/L，抗生素的去除率在95%以上，可能長時間的運行導致生物膜中耐藥微生物的生長，提高了系統對抗生素的降解能力。
在逐步提高進水抗生素濃度的過程中，COD和氨氮的去除在初期都受到不同程度的沖擊，去除率都呈現下降趨勢，但是經過一定時間的恢復后，去除效果會有所恢復和提升(見圖5)。在抗生素濃度為1000μg/L左右時，BAF對氨氮、COD的去除率分別為98%和82%左右，表明濾柱中的菌群結構受到了抗生素的沖擊，但是經過一定時間后會有所恢復，但整體上去除率隨抗生素濃度的增加均呈下降趨勢。為了能進一步解釋微生物的降解作用，對濾柱中的菌群演替規律做了進一步的分析。
2.3 微生物菌群演替規律
2.3.1 物種多樣性及豐度指數分析
首先對高通量測序序列進行OTU劃分，對97%相似水平下的OTU進行生物信息統計。在生態學中Chao1指數常用來估計物種總數，Ace指數用來估計種群中OTU數目，Shannon指數和Simpson指數都用來估計樣品中微生物多樣性，結果見表1。實驗中Coverage均大于0.998，反映了本次測序結果可以代表樣本的真實情況。
由表1可知，進水投加200μg/L抗生素以后樣品的OTU指數、Shannon指數、Chao1指數和Ace指數均有不同程度的下降，而Simpson指數提高，這說明抗生素的加入對BAF中的微生物影響較大，抑制作用明顯，致使微生物群落的豐富度和多樣性下降。但是對比樣品Ⅱ、Ⅲ可以發現，延長HRT以后樣品的OTU指數、Chao1指數和Ace指數都略有提高，說明延長HRT條件下微生物多樣性略有增加。而Simpson指數顯著降低，也同時說明了BAF中微生物群落優勢度在減小，多樣性在增加，但微生物群落豐富度變化并不明顯。所以較長的HRT，更有利于BAF中各種微生物適應抗生素的沖擊。
2.3.2 群落結構組成演替規律分析
選取樣本中相對豐度大于1%的門做門水平種群分類，共篩選出8個菌群，結果如圖6所示。在添加3種四環素類抗生素后，微生物群落在門水平上產生的變化較大，門種類降低。其中Proteobacteria(變形菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)在添加抗生素前后均為優勢菌群，且相較于添加抗生素之前，Proteobacteria豐度顯著升高，由43.63%分別升高為75.55%和77.34%。大量研究表明，Proteobacteria菌群在很多難降解污染物的降解過程中都起到了重要作用，Proteobacteria菌群是BAF具備較好的污染物去除效果及較高的四環素類抗生素去除率的關鍵。Bacteroidetes豐度也有所上升，由11.01%升至18.34%和14.04%。研究表明，Proteobacteria和Bacteroidetes是脫氮系統中兩種關鍵異養菌群，在好氧生物處理系統中普遍存在。添加抗生素之后Planctomycetes(浮霉菌門)豐度由14.94%分別下降為0.34%和0.35%；Acidobacteria(酸桿菌門)豐度由12.72%分別降為0.02%和0.05%，說明3種四環素類抗生素抑制了曝氣生物濾池中Planctomycetes和Acidobacteria的生長。此外，Actinobacteria(放線菌門)在三個樣品中豐度分別為3.63%、4.12%和0.46%，其豐度受HRT影響較大，HRT延長到10h導致進水負荷降低是Actinobacteria豐度下降的主要原因。
選取相對豐度大于1%的綱做種群分析，共篩選出10個菌群。與大多數好氧反應器中的菌群研究相同，在Proteobacteria門中Gammaproteobacteria(γ-變形桿菌綱)、Alphaproteobacteria(α-變形桿菌綱)和Betaproteobacteria(β-變形桿菌綱)為主要的優勢菌群。在四環素類抗生素作用下，系統中Proteobacteria門相對豐度增加主要是由β-變形桿菌綱增加引起的。在本實驗中，β-變形桿菌綱豐度由添加抗生素之前的2.23%上升至45.04%和35.74%，其豐度的顯著增加可能與它們獲得抗生素耐藥基因擁有耐藥性有關。β-變形桿菌綱中的菌群可以適應復雜的環境，在抗生素廢水處理中經常被檢測到。Alphaproteobacteria豐度由添加抗生素之前的15.22%上升至28.28%和27.77%，α-變形桿菌綱與β-變形桿菌綱相似，可能在含有抗生素的環境中占據優勢。γ-變形桿菌綱豐度由添加之前的24.57%下降至2.18%和13.79%。γ-變形桿菌綱豐度變化與其他菌群不同，在不同的HRT條件下其豐度存在差異，因為HRT的延長，降低了抗生素的負荷，在低抗生素負荷下其豐度有所恢復，說明在Proteobacteria門中γ-變形桿菌綱似乎比α-變形桿菌綱和β-變形桿菌綱對四環素類抗生素負荷更敏感。另外，Bacteroidetes門中Flavobacteriia(黃桿菌綱)和Sphingobacteriia(鞘脂桿菌綱)在加入抗生素后豐度變化明顯。
選取菌群中含量變化較大的屬做種群分類，結果如圖7所示。樣品Ⅰ中屬水平微生物菌群豐富，其中Enterobacter(腸桿菌屬)的豐度最高達到12.76%，在好氧生物工藝中Enterobacter是一種異養硝化細菌，具有高效硝化作用，但是由于抗生素的加入，大大抑制了Enterobacter的生長，在樣品Ⅱ和樣品Ⅲ中幾乎沒有被發現，說明此類菌屬對抗生素較為敏感。
另外，unclassifiedPlanctomycetaceae和unclassifiedAcidobacteriaGp4這兩種普遍存在于污水生物處理系統中的專性好氧菌屬也受到了抗生素的抑制。這也可以解釋為什么抗生素加入后系統對氨氮和COD的去除率均出現了下降的現象。值得關注的是，在樣品中許多菌屬并未受到抗生素加入的影響。添加抗生素之后樣品Ⅱ和樣品Ⅲ中Acidovorax(嗜酸菌屬)是zui you勢的菌屬，相對豐度分別為43.88%和21.98%，Acidovorax在抗生素廢水處理中發揮重要的作用，參與某些抗生素的降解過程；unclassifiedRhizobiaceae(未分類的根瘤菌屬)是Alphaproteobacteria綱中豐度最大的菌屬，有促進微生物生長和生物膜形成的作用，此類菌種在濾柱樣品中的豐度分別為3.58%、21.39%和17.65%，促進了生物膜的形成，對污染物的去除起到了重要的作用。延長HRT后，Gammaproteobacteria綱中的unclassifiedXanthomonadaceae(未分類的黃單胞菌屬)豐度由1.70%升高至10.20%，其能夠利用碳源進行生長繁殖，豐度增加有助于反應器中有機物的去除；Betaproteobacteria綱中的Acidovorax豐度雖然有所降低，但仍為優勢菌屬，同時Flavobacteriia綱中的Flavobacterium(黃桿菌屬)豐度由2.59%升高至12.07%，Chryseobacterium(金黃桿菌屬)豐度由15.61%下降至0.88%，Flavobacterium取代后者成為優勢菌屬，Flavobacterium和Chryseobacterium兩種菌屬存在相似性，均具有降解有機物的作用，Chryseobacterium對有機物變化比Flavobacterium更加敏感，延長HRT減少了單位時間內進入反應器中有機物的數量從而促進了這兩種菌群的更替。其中優勢菌屬中Acidovorax、Flavobacterium均具有反硝化功能，總體上四環素類抗生素的加入促進了此類具有反硝化作用的菌屬生長。
3、結論
①在利用BAF處理抗生素廢水過程中，氨氮、COD的去除效果穩定。四環素類抗生素的去除率隨著水力停留時間的增加而提高，在進水濃度為200μg/L、水力停留時間為10h時，四環素類抗生素的去除率均在82.5%以上，其中CTC去除率在99%以上。
②逐步提高進水抗生素濃度，BAF對氨氮、COD的去除率均略有降低，分別為98%、82%，對抗生素的去除率仍呈現提高的趨勢，抗生素濃度為1000μg/L時，濾柱對CTC的去除效果zui hao，達到99%，對OTC和TC去除率可以達到95%。
③投加抗生素后，BAF中微生物種群多樣性明顯降低。Proteobacteria(變形菌門)是主要的菌群且豐度變化最大；α-變形桿菌綱、黃桿菌綱和β-變形桿菌綱豐度顯著增加，這些菌群均可以適應抗生素廢水；濾柱中一些常見菌屬受到抑制，其中包括具有硝化功能的菌屬Enterobacter(腸桿菌屬)在系統中wanquan被抑制，具有反硝化作用的Acidovorax(嗜酸菌屬)和Flavobacterium(黃桿菌屬)豐度顯著增加，在抗生素廢水處理中起到重要作用。
