產(chǎn)品編號： EIA05548
使用前*閱讀說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于經(jīng)典酶聯(lián)夾心技術(shù)原理，能測量大鼠分泌型免疫球蛋白A（SIgA），只能用于研究用途，不得用于醫(yī)學(xué)診斷。

工作原理
分泌型免疫球蛋白A（Secretory immunoglobulin A，sIgA）是Chodircker和Tomas等在60年代初首先在人外分泌液中發(fā)現(xiàn)的一種IgA類抗體，它與血清中IgA無論在理化性質(zhì)或免疫學(xué)性質(zhì)上均不相同。sIgA 是黏膜免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，主要存在于淚液、唾液、乳汁和呼吸道、消化道及泌尿生殖道等黏膜表面分泌液中。粘膜的表面存在著分泌性免疫（Secretory immunity），而粘膜表面的IgA提供了*道免疫防線。sIgA是粘膜組織免疫應(yīng)答的特征，sIgA抗體可通過阻礙粘膜與細(xì)菌和病毒的接觸從而給粘膜表面提供特殊的免疫屏障。胃腸道是sIgA的中樞器官。sIgA是機(jī)體內(nèi)分泌量zui多的免疫球蛋白，分泌量zui高可達(dá)30~100 mg/（d•kg）。slgA是多聚體，因此它能和病毒、細(xì)菌、寄生蟲或它們的毒素交叉連接而形成一個大分子的復(fù)合物。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（ELISA）。預(yù)先包被的抗體為多克隆抗體。檢測相抗體也為多克隆抗體，經(jīng)*（biotin）標(biāo)記。樣品和*標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關(guān)。

每套試劑盒中內(nèi)容（96T）

材料 數(shù)量
標(biāo)準(zhǔn)品 96T（2vial）
預(yù)包被抗體的96孔板 96T（8×12）
*標(biāo)記抗體 96T （1:100）
ABC（親和素-過氧化物酶復(fù)合物） 96T （1:100）
樣品稀釋液 96T×2
抗體稀釋液 96T×1
ABC稀釋液 96T×1
TMB顯色液A 96T×1
TMB顯色液B 96T×1
TMB終止液 96T×1
ELISA洗滌液 96T×1（1:25）

需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱。
2． 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
3． 自動洗板機(jī)。
4． 單通道或多通道可調(diào)節(jié)移液器以及其吸頭。
5． 蒸餾水，容量瓶等
6． 干凈的試管和Eppendof管。

注意事項
1． 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
2． 配制各種試劑時，切記混勻！
3． 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
4． 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本都做雙份檢測。
5． 要嚴(yán)格避免操作過程中酶標(biāo)板干燥。干燥會使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活！
6． 為免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

樣品的準(zhǔn)備和保存
樣品如果不立即分析，應(yīng)分裝后冷凍保存，且避免反復(fù)凍融。
血清——用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時或4℃過夜，離心1000×g 10分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
細(xì)胞培養(yǎng)、組織勻漿、體液——離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱文獻(xiàn)了解標(biāo)本內(nèi)待測因子的含量，決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測范圍。樣品的稀釋應(yīng)有詳細(xì)記錄。

試劑的準(zhǔn)備和保存
A. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和使用：在使用前2小時內(nèi)準(zhǔn)備。將凍干品管內(nèi)加入1ml樣品稀釋液，*溶解后做倍比稀釋。
稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品在2小時內(nèi)使用。

B．*標(biāo)記抗體工作液：在使用前2小時內(nèi)準(zhǔn)備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul*標(biāo)記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

C．親和素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）工作液的準(zhǔn)備：在使用前1小時內(nèi)準(zhǔn)備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實配時應(yīng)多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul親和素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。
D. TMB顯色工作液的準(zhǔn)備：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液。

操作程序
1． 確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目。
2． 將倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對照。處理后的標(biāo)本按100ul每孔加入。
3． 酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)90分鐘。
4． 反應(yīng)后用自動洗板機(jī)吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體；或甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
5． 將準(zhǔn)備好的*抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)60分鐘。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。
7． 將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)30分鐘。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。
9． 按每孔0.09ml依次加入已在37℃平衡30分鐘的TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)，反應(yīng)過程中，要經(jīng)常的觀察，當(dāng)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔差別不明顯時，即可加入TMB終止液0.1ml/孔。（顯色反應(yīng)zui長不要超過30分鐘）。
10． 用酶標(biāo)儀在450nm測定O.D.值。
11． 根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對應(yīng)的濃度。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了N倍，其實際濃度應(yīng)該×N。

操作程序總結(jié)：
準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)90分鐘

洗板2次，加入*化抗體工作液，37℃反應(yīng)60分鐘

洗板3次，加入ABC工作液，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板5次，加入TMB顯色液，37℃反應(yīng)

加入TMB終止液

30分鐘之內(nèi)讀OD值

計算標(biāo)本待測因子含量

檢測范圍： 100ng/ml→1.56ng/ml。
敏感性： ＜0.5ng/ml
特異性： 系統(tǒng)和其它細(xì)胞因子無交叉反應(yīng)。
保存： -20℃ [短期內(nèi)（如兩周）可4℃]
有效期： 12個月（-20℃）。
用途： 用于體外定量分析液體標(biāo)本（通用型）。
REFERENCES
1． Avwenagha O,Campbell G,Bird MM.The outgrowth response of the axons of developing and regenerating rat retinal ganglion cells in vitro to neurotrophin treatment[J].J Neurocytol 2003;32（9）:1055-1075.
2． Garcia M,Forster V,Hicks D,Vecino E.In vivo expression of neurotrophins and neurotrophin receptors is conserved in adult porcine retina in vitro[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44（10）:4532-4541.
3． von Bartheld CS,Butowt R.Expression of neurotrophin-3（NT-3） and anterograde axonal transport of endogenous NT-3 by retinal ganglion cells in chick embryos[J].J Neurosci 2000;20（2）:736-748.
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