酶底物法與多管發酵法和紙片法測定水中糞大腸菌群方法比較

2022年08月31日 13:53:05人氣：4152來源：河南綏凈環保科技有限公司

　　糞大腸菌群是總大腸菌群的一部分，又稱耐熱大腸菌群。生長于人與部分動物體內腸道中，水體中的糞大腸菌群主要來自糞便污染，因此通過測定水中糞大腸菌群的含量，可間接得出水體受糞便污染的情況，在環境監測和衛生防疫方面具有重要意義

　　本文對比三種不同糞大腸菌群的檢測方法，通過比較多管發酵法、紙片快速法和酶底物法的檢測結果，討論酶底物法檢測糞大腸菌群的可行性及應用。

　　一、檢測方法及原理

　　1、多管發酵法

　　將水樣接種于乳糖蛋白胨培養基的發酵管中，在37±0.5℃下培養24±2 h進行初發酵試驗，大腸菌群生長繁殖產酸產氣，產酸使乳糖蛋白胨培養液中的p H降低，發酵管由紫色變黃色;產氣使發酵管中導管產生小氣泡，產酸或產氣則為陽性，否則為陰性。

　　將顯陽性的發酵管接種至EC培養液，在44.5±0.5℃下培養24±2 h進行復發酵，造成不利于自然環境中的大腸桿菌生長的條件，而糞大腸菌群將會在44.5℃下繼續存活生長繁殖，由此通過復發酵管中產氣情況判定陽性。

　　通過復發酵后顯陽性的發酵管數，查詢MPN表，通過統計學方法計算出糞大腸菌群濃度。

　　2、紙片快速法

　　通過將水樣接種于吸附了溴甲酚紫和2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑 (TTC) 以及乳糖等營養成分的無菌濾紙上，在44.5±0.5℃下培養18～24 h，當糞大腸菌繁殖產酸使溴甲酚紫變黃色，產氣使相應的脫氫酶催化底物TTC形成紅色的不溶性三苯甲臢 (TTF) ，在黃色背景顯示出紅色的斑點或紅暈，判定糞大腸菌群存在，該接種紙片顯陽性，通過查詢MPN表計算出相應濃度值。

　　3、酶底物法

　　將已加入培養基的水樣混勻與97孔定量盤，置于44.5±0.5℃培養24h，糞大腸菌能在該溫度產生β-半乳糖苷酶 (β-D-galactosidase) ，分解選擇性培養基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖 (ONPG) 生成黃色的鄰硝基beng酚，通過定量盤大小孔顯黃色數查詢酶底物法的MPN表，計算出糞大腸菌群的濃度。

　　二、實驗步驟

　　根據水樣污染程度選擇不同的稀釋倍數，將水樣接種于乳糖蛋白胨培養基的發酵管中，在37±0.5℃下培養24±2 h進行初發酵試驗，產酸產氣顯陽性;將顯陽性的發酵管用3 mm接種環接種至EC培養液，在44.5±0.5℃下培養24±2 h進行復發酵，發酵管內小導管有氣泡則顯陽性，記錄陽性管數，查對應MPN表，計算結果。

　　1、紙片快速法

　　根據水樣污染程度，樣品按照三個10倍遞減的不同接種量接種，每個接種量分別接種5張紙片，共接種15張紙片。接種水樣應均勻滴加在紙片上，紙片充分浸潤、吸收水樣，用手在聚丙烯塑膜袋外側輕輕撫平，做好標記。接種后立即放置44.5±0.5℃的培養箱中培養18～24 h后，通過紙片上顏色變化判定陽性紙片數，查詢對應MPN表，計算結果。

　　2、酶底物法

　　根據水樣受污染程度，進行樣品稀釋，將商品化酶底物培養基加入100 ml待測樣品中，充分混勻，*溶解后全部倒入97孔定量盤中，撫平定量盤背面，趕出氣泡，用程控定量封口機封口。放置于44.5±0.5℃的培養箱中培養24 h后于標準陽性比色盤對比，根據陽性孔數查詢對應的MPN表，計算結果。

　　三、結果與討論

　　1、實驗結果與數據分析

　　實驗開始前對使用的玻璃器皿按要求進行滅菌操作，制備無菌水時檢驗純水質量并進行滅菌操作，并開啟實驗室紫外燈對細菌室滅菌2 h以上。

　　根據方法標準和《水和廢水監測分析方法 (第四版) 》要求，分別用滅菌水對每批次樣品培養基 (培養紙片) 進行全程序空白和實驗室空白檢驗，均未檢出，亦無任何顏色或氣泡等明顯變化。

　　每次實驗均用大腸埃希氏菌和產氣腸桿菌做陽性、陰性對照，且大腸埃希氏菌對照組樣品均顯陽性，產氣腸桿菌對照組均顯陰性。

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