DNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型）使用說明書

（貨號：WLE8202KIT）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點形成D-loop區域，并開始對DNA雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區域后，復合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。本試劑盒在39 ºC下，依賴核酸外切酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用熒光監測設備能實現對目標片段擴增過程的實時監控。

產品特點：

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時間短（僅需20 mins）等優點，反應組分為干粉狀態，操作簡便，易于保存。

可適用于各種品牌的熒光定量PCR儀、恒溫熒光擴增儀器等熒光檢測設備。

引物設計：

建議使用長度在30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

熒光探針設計：

探針序列不與特異性引物識別位點重疊，長度為46-52 nt，序列避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基。探針共有四個修飾位點：距離5’端的≥35 nt的中部位置標記一個dSpacer（，THF），作為核酸外切酶的識別位點；THF位點的上游標記一個熒光基團，下游標記一個粹滅基團，兩個基團的間距為2-4 nt；THF距離3’末端≥15 nt，并且3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer。

試劑盒組成：

試劑盒儲存：

運輸條件：低溫運輸；

儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 ºC，避光保存，避免重壓、反復凍融；

產品有效期：12個月。

操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

1)    每個干粉反應管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需*融化混勻，否則會對實驗效果產生影響）；

2)    每個反應管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應管中）；

3)    向反應管中依次加入11.5 μL ddH₂O和2 μL核酸模板（可根據核酸濃度調整加入的核酸模板體積，并相應調整加入的ddH₂O體積，至模板與ddH₂O總體積為13.5 μL）；

4)    zui后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（對于多個反應，建議將B buffer加至反應管的蓋子內側，上下顛倒反應管8-10次混勻）；

5)    混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入熒光檢測設備中。熒光檢測程序設置為：恒溫39 ºC；每30 s采集一次FAM通道（信號采集通道的選擇與熒光探針設計一致）熒光值；反應時間20 mins。

注：如使用ABI系列PCR儀，請務必于passive reference和quencher處均選擇“none”。

體系配制                             正對照熒光結果圖

*正對照反應單元體系配制：正對照模板加入2μL，引物與探針加入4.6 μL正對照引物探針Mix（已包含探針和上/下游引物），其他組分參照體系配制。

注意事項：

1．  由于試劑盒靈敏度非常高，在進行反應時請注意避免微量核酸污染，并盡量考慮設置空白對照以確認是否有核酸污染。

2．  試劑盒保質期12個月。每次使用時，請取出實驗所需的MIRA反應單元的數量，置于冰浴條件下并在8小時內使用；剩余部分，請置于存儲條件下。